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(无效剂量)组在抗PD-1治疗前后的差异表达基因(P<0.01，倍增≥2和最小二乘平均≥5)。通过将IgG队列中4Gy-RT上调的基因与抗PD-1队列重叠，我们识别了144个特定于该有效辐射剂量上调的基因(图3a和扩展数据图5a)。为了确定这4个Gy-RT特征基因的细胞来源，我们对接受0Gy或4Gy-RT的HKP1荷瘤肺进行了单细胞RNA-seq(sA-seq)分析。通过将144个签名基因投影到t分布随机邻居嵌入(t-SNE)图，我们发现这些基因在4Gy-RT后在气道上皮/棒状细胞簇中显著上调(图3b)。
棒状细胞分泌体与联合治疗的疗效有关
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无论采用哪种耗竭方法，携带HKP1的肺对4Gy-RT的免疫反应均明显减弱，表现为T细胞向肿瘤胰岛的浸润显著减弱，效应细胞因子的产生减少(CD4+T细胞中的干扰素-γ/肿瘤坏死因子-a和CD8+T细胞中的GzmB)(图4C和扩展数据图6d)。值得注意的是，在HKP1荷瘤小鼠中，棒状细胞缺陷取消了联合治疗的疗效(图4d)。
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电子显微镜对棒状细胞的进一步表征显示，与对照组相比，从4Gy-RT治疗的肺中分离出的棒状细胞中分泌囊泡的数量增加(扩展数据图8a，b)。我们推测放疗后棒状细胞的分泌可能在提高ICIs疗效中起作用。为了解决这个问题，我们使用Scgb1a1-CreERTM/Snap23Flox/Flox转基因小鼠(简称Scgb1a1cre/Snap23fl/fl)阻止棒状细胞分泌蛋白进入肺TME。突触体相关蛋白23(SNAP23)是SNARE复合体的关键成分，它介导细胞内囊泡融合到膜上，调节胞吐。他莫昔芬治疗Scgb1a1cre/Snap23fl/fl小鼠允许有条件的棒状细胞特异性缺失Snap23基因(图5a)，而不改变细支气管的完整性(扩展数据图8c)。对支气管肺泡灌洗液(BALF)的分析证实，与野生型对照相比，4Gy-RT治疗的Scgb1a1cre/Snap23fl/fl小鼠的棒状细胞分泌组成分CC10显著减少(图5b)。与棒状细胞消融一致，SNAP23缺乏抑制了HKP1肺对4Gy-RT反应中T细胞的浸润和激活(图5c和扩展数据图8d)。
棒状细胞减少促肿瘤炎症
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球状细胞缺陷(DT治疗)小鼠的肺显示髓系/淋巴细胞比率增加(Mye/LYM，对照组和DT治疗小鼠分别为0.96和1.34，图6a)。此外，杆状细胞缺陷肺中的髓样细胞表现出炎症介质的表达增加，如IL1b、PTGS2和TNF(图6b)，据报道它们可以抑制适应性抗肿瘤免疫。我们推测这些棒状细胞介导的TME改变可能影响了T细胞效应器的表型。使用基于图形的分类，T细胞被分成9个簇(图6c)，每个簇的功能状态根据它们的特征基因来确定(图6c和补充表2)。我们观察到效应T细胞簇(C5)显示细胞因子、效应分子(干扰素-γ和肿瘤坏死因子)和T细胞活化标志物(PDCD1和)表达增加，增殖T细胞簇(C9)显示颗粒酶和Ki67表达，调节性T细胞簇(C8)显示Foxp3和IL2ra表达(图6c)。值得注意的是，与对照组(分别为2.63和1.96)相比，去杆状细胞(DT治疗)降低了效应器、增殖T细胞和Treg细胞的比率((C5+C9)/C8)。总之，这些sA-seq结果表明，RT激活的棒状细胞的存在有助于适应性抗肿瘤免疫，可能是通过限制HKP1肿瘤中髓系细胞介导的炎症。BALF样本的ELISA检测显示，与0Gy对照组相比，4Gy-RT显著降低了HKP1TME中IL-1β、PGE_2和TNF-a的水平(图6d)，但在没有棒状细胞(DT处理的Scgb1a1cre/iDTR)或其分泌体(Scgb1a1cre/Snap23fl/fl)的情况下，4Gy-RT未能减少这些炎症因子(图6d)。为了证明RT诱导的棒状细胞分泌体的临床相关性，我们在II期新辅助临床试验(NCT02904954)54中评估了接受RT联合ICIs(抗PD-L1)治疗的NSCLC患者的血浆水平。分别于首次立体定向全身放射治疗(SBRT)前1d和末次SBRT后1d采集血浆。匹配患者的CC10血浆浓度比较(放疗前和放疗后)显示，大多数获得病理改善的患者在放疗后血浆CC10水平升高(8人中有5人)，而无反应的患者(9人中有0人，P=0.0301)(图6e)，表明棒状细胞激活与联合治疗的病理反应有关。综上所述，这些发现表明，RT激活的棒状细胞通过其分泌体抑制了H